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      免疫沉澱是用於抗原檢測和純化的廣泛使用的方法之一
      更新時間:2020-08-11 點擊次數:1084次
       
        
        免疫沉澱是利用抗原抗體特異性反應,從特定混合物(通常是細胞裂解液或表達上清)中純化富集目的蛋白的一種方法。傳統的IP實驗是抗體與目的蛋白結合後,再與蛋白ProteinA/G(結合抗體Fc片段)偶聯的瓊脂糖或磁珠孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白複合物,複合物經過洗滌、洗脫後用於後續下遊實驗。IP是許多蛋白質相關研究的重要步驟,用於研究蛋白質的存在、相對豐度、蛋白表達的上下調、蛋白至穩定性及相互作用等。
        
        免疫沉澱的原理為:針對特定靶蛋白的抗體與樣品(細胞裂解物等)中的靶蛋白形成免疫複合物,隨後利用ProteinA-磁珠或ProteinG-磁珠將該免疫複合物從混合物中沉澱下來。後將靶蛋白從磁珠上洗脫(如果抗體沒有共價連接到磁珠上或使用變性緩衝液進行洗脫,抗體也會被洗脫下來),並通過SDS-PAGE,WesternBlot等手段對洗脫下來的蛋白進行分析。
        
        免疫沉澱固相物質的選擇:
        
        對於小型特定蛋白和蛋白複合物的分離,磁珠可實現結合能力、得率、可重複性、純度和成本節約之間的平衡。當進行手動和自動化標準IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反應並立即用於後續檢測分析時,磁珠是理想選擇。利用強力磁力架可將磁珠定位到孵育管的側壁,使其不阻礙細胞裂解物抽吸。磁性分離不需要離心,所以不會導致抗體-抗原結合破壞和目標蛋白損失現象。當需要純化大量目標蛋白用於下遊分析,且特異性抗體較易獲得,瓊脂糖樹脂純化較為適用。
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